1. Isolasi DNA kromosom dan plasmid
DNA kromosom yang berasal dari sel sumber (sel prokariot) dan DNA plasmid (vektor) diisolasi.
2. Pemotongan DNA kromosom dan plasmid
DNA hasil isolasi (DNA kromosom sel sumber&DNA plasmid) di potong menggunakan salah satu enzim restriksi yang sama, dimana situs enzim restriksinya terletak pada gen marker plasmid. Misal plasmid yang digunakan adalah PBR322 yang memiliki gen marker resisten ampisilin dan tetrasiklin, salah satu situs enzim yang terletak pada daerah marker tetrasiklin adalah SAL1. DNA plasmid menjadi linier dan DNA kromosom sel sumber membentuk fragmen-fragmen DNA.
3. Ligasi fragmen-fragmen DNA kromosom dengan plasmid linier
Proses Ligasi fragmen DNA dengan DNA plasmid. Proses ini akan menghasilkan 3 kemungkinan, yaitu DNA rekombinan yang membawa gen target,DNA rekombinan tanpa gen target,DNA yang religasi.
4. Transformasi sel inang kompeten dengan DNA hasil ligasi
proses Transformasi, yaitu Memasukkan DNA hasil ligasi kedalam sel inang misal. Bakteri,maka akan didapat 4 kemungkinan, yaitu : Sel inang dengan rekombinan tanpa gen target, sel inang dengan rekombinan membawa gen target, sel inang dengan plasmid yang religasi, sel inang yang utuh (nontransforman).
5. Seleksi transforman dengan media selektif
Untuk mengetahui transformasi berhasil atau tidak maka diadakan seleksi dengan media ampisilin, apabila sel inang yang berhasil dimasukki plasmid maka ia akan hidup di media ampisilin karena sel inang tersebut berhasil dimasukki plasmid yang memiliki gen resisten ampisilin. Apabila sel inang mati maka sel inang tersebut tidak berhasil ditransformasi (dimasukki plasmid).
6. Seleksi transforman rekombinan dengan media selektif
Lalu diadakan seleksi untuk menentukan sel inang yang mengandung DNA rekombinan. Caranya dengan menumbuhkan pada medium yang mengandung Ampisilin dan tetrasiklin, apabila sel inang hidup di ampisilin dan tetrasiklin maka sel inang tersebut adalah nontransforman atau sel inang yang dimasuki plasmid religasi. Jika sel inang tersebut hidup di ampisilin dan mati di tetrasiklin maka sel inang tersebut berhasil dimasuki DNA rekombinan baik yang mengandung gen target atau tidak.
